摘要：目的优选消乳增胶囊中7味药材的提取工艺参数。方法采用HPLC测定芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、欧前胡素、藁本内酯的含量，以此5种指标成分的提取率、药材提取的干膏得率和提取物指纹图谱相似度为综合评价指标，通过正交试验考察乙醇浓度、提取溶剂倍量、提取时间和提取次数对提取工艺的影响，采用信息熵赋权法确定各指标的客观权重，优选消乳增胶囊中7味药材的提取工艺参数。结果根据综合评分结果，确定该制剂最佳提取工艺为选用6倍量的50%乙醇，煎煮2次，每次2h。3批验证综合评分均值为99.72，RSD为0.24%。结论优选后的工艺提取率高、稳定性和重复性好，适用于该制剂的大批量生产。
消乳增胶囊（XiaoruzengCapsules，XC）由当归、白芷、白芍、陈皮、青皮、丹参等共18味药材配伍而成，具有疏肝理气、通络止痛的功能，临床上用于治疗乳痈、乳腺增生症。XC的制剂工艺是将处方中的白芍、白芷、当归、陈皮、青皮、元胡、甘草这7味药材直接打粉，再跟方中剩余药材的水提物干燥粉末混合制成胶囊。该工艺因多味药材直接粉碎产生约70g粉末，致使出现临床服用量大（18粒/d）的问题，导致患者的依从性降低，并且增加其治疗成本。因此，本研究针对制剂中的这7味药材进行提取工艺研究。
中药成分复杂，提取工艺优化时一般需要测定多个指标成分，再根据权重系数确定综合评分，进而得到最佳工艺方案。其中，权重系数是反映提取工艺参数的重要性指标，熵权法是评定客观权重系数的方法之一[1-3]，其依据熵的概念和性质，通过量化各种指标信息，得到指标权重系数的一种方法[4-5]。指纹图谱是一种借助于分析技术获得中药化学成分的谱图，能较为全面地反映研究对象的化学成分组成信息，有利于中药复方制剂内在整体质量表征、综合评价和全面控制，适用于成分分析和质量控制研究[6-11]。
本研究以乙醇作为提取溶剂，采用L9(34)正交试验，以乙醇体积分数、提取溶剂倍量、提取时间和提取次数为考察因素，以药效成分（芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、欧前胡素、藁本内酯）的提取率、药材提取的干膏得率和提取物指纹图谱相似度为评价指标；基于信息熵理论对各指标赋权重分析，获得客观权重，根据综合评分得到最佳提取工艺参数，为该制剂的后续药理药效研究提供依据。
1材料与仪器
1.1仪器与试剂
BSA-CW分析天平，德国Sartorius公司；PTHW型调温电热套，巩义市予华仪器有限责任公司；RE-B旋转蒸发器，郑州市亚荣仪器有限公司；AISETYLD-真空干燥箱，上海亚泰仪表有限公司；SHZ-95P循环水式多用真空泵，郑州市亚荣仪器有限公司；超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；Agilent高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；提取用乙醇为无水乙醇，分析纯；用水为一级水，实验室自制；甲醇、甲酸、乙腈，色谱纯，美国天地公司。
1.2试药
白芍PaeoniaeRadixAlba（批号）、白芷AngelicaeDahuricaeRadix（批号）、当归AngelicaeSinensisRadix（批号）、陈皮CitriReticulataePericarpium（批号）、青皮CitriReticulataePericarpiumViride（批号）、元胡CorydalisRhizoma（批号）、甘草GlycyrrhizaeRadixetRhizoma（批号）均购自于甘肃冠兰中药饮片有限公司。经甘肃中医药大学中药鉴定教研室杨扶德副教授鉴定分别为毛莨科芍药属植物芍药PaeonialactifloraPall.的干燥根、伞形科当归属植物白芷Angelicadahurica(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.的干燥根、伞形科当归属植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根、芸香科柑橘属植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥成熟果皮、芸香科柑橘属植物橘CitrusreticulataBlanco的干燥幼果及未成熟果实的果皮、罂粟科紫堇属植物延胡索CorrydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎、豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎，均符合《中国药典》年版有关规定。
对照品芍药苷（批号-，规格25mg，质量分数97.4%）、欧前胡素（批号-，规格25mg，质量分数99.6%）、阿魏酸（批号-，规格50mg，质量分数99.0%）、橙皮苷（批号-，规格20mg，质量分数96.2%）均购自中国食品药品检定研究院；对照品藁本内酯（批号，规格20mg，质量分数98%），购自上海融禾医药科技有限公司。
2方法与结果
2.1样品的制备
称取处方量的当归、白芷、白芍、陈皮、青皮、元胡、甘草，共9份，粉碎成小碎块后置于圆底烧瓶中，用提取溶剂浸泡30min，按正交表安排的条件进行提取，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至mL，待用，样品依次编号S1～S9。
2.2含量测定
2.2.1色谱条件色谱柱为AgilentZorbaxSBC18柱（mm×4.6mm，5μm）；柱温40℃；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈；DAD检测器，检测波长nm；体积流量1.0mL/min，样品进样量10μL。理论塔板数应不低于。梯度洗脱程序：0～4min，8%～20%乙腈；4～10min，20%～23%乙腈；10～20min，23%～50%乙腈；20～25min，50%～55%乙腈；25～30min，55%～80%乙腈；30～35min，80%～%乙腈；35～40min，%乙腈。
2.2.2供试品溶液的配制精密量取“2.1”项下各提取液2mL置于10mL量瓶中，加甲醇至近刻度线，摇匀，超声30min，放冷后定容至刻度线，微孔滤膜滤过，取续滤液即得供试品溶液。
2.2.3混合对照品溶液的制备精密称取芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、欧前胡素、藁本内酯的对照品适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度分别为0.、0.、0.、0.、0.mg/mL的混合对照品溶液，备用。
2.2.4系统适应性试验与专属性考察按“2.2.1”项下色谱条件，分别进样分析混合对照品溶液、供试品溶液，色谱结果显示，5种活性成分与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，并且各组分互不干扰，理论塔板数大于，表明该方法专属性较好。色谱图见图1。
2.2.5线性关系考察精密量取混合对照品溶液2、3、1、1、1mL，分别置于5、10、5、10、25mL量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，即得各质量浓度梯度混合对照品溶液。按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得各成分线性回归方程、相关系数（r）及线性范围分别为芍药苷Y＝.4X＋.9，r＝1.，线性范围1.84～18.40μg；阿魏酸Y＝.1X＋.6，r＝1.，线性范围1.2～12.0μg；橙皮苷Y＝.0X－.8，r＝0.，线性范围0.～0.μg；欧前胡素Y＝.8X＋.5，r＝0.，线性范围0.～0.48μg；藁本内酯Y＝.0X＋.9，r＝1.，线性范围0.66～6.60μg。结果表明，在相应进样量范围内各成分线性关系良好。
2.2.6精密度试验按“2.2.1”项下色谱条件，连续测定混合对照品溶液6次，记录峰面积。结果显示5个成分的峰面积RSD在0.35%～0.86%，表示该仪器精密度良好。
2.2.7重复性试验在相同提取条件下，按“2.1”项下的方法平行制备6份S1样品，标号I～VI，分别根据“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件测定，记录峰面积并计算质量分数。结果显示5个成分的质量分数RSD在0.37%～1.13%，说明该方法重复性良好。
2.2.8稳定性试验精密量取“2.2.2”项下S1供试品溶液适量，室温放置，分别于0、3、6、12、18、24、36h，经HPLC测定，记录峰面积。结果显示5个峰面积RSD在0.58%～1.02%，说明室温下供试品溶液在36h内基本稳定。
2.2.9加样回收率试验精密吸取6份“2.1”项下已知含量的S1样品浓缩提取液，每份1mL，分别置于10mL量瓶中，每份精密加入欧前胡素、阿魏酸、藁本内酯、芍药苷、橙皮苷混合对照品溶液各1mL，加甲醇至近刻度线，摇匀，超声30min，放冷后定容至刻度线，微孔滤膜滤过。每份续滤液精密吸取10μL进样，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果5个成分的平均回收率分别为99.81%、.02%、.52%、98.97%、.40%，RSD分别为1.06%、0.89%、1.20%、0.77%、0.95%。
2.3干膏得率的测定
精密量取“2.1”项下各提取液20mL分别置于已干燥至恒定质量的蒸发皿中，放置真空干燥箱（55℃）中至恒定质量，取出，先置于干燥器中冷却30min后迅速精密称量，计算干膏得率［YG，YG＝(干浸膏质量×/药材质量×20)］，结果见表1。
2.4正交设计优化XC提取工艺
2.4.1正交试验方案影响提取效率的实验因素主要包括[12-13]：乙醇体积分数（A）、提取溶剂倍量（B）、提取时间（C）、提取次数（D），以此4个因素建立4因素3水平正交设计，选用L9(34)安排正交试验，因素水平见表1。
2.4.2正交试验结果按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算各成分的提取率（提取率＝浸膏中相应指标的质量/药材中相应指标的质量，芍药苷、阿魏酸、橙皮苷、欧前胡素、藁本内酯的提取率依次以Y1～Y5表示），药材中指标成分含量依饮片检验报告得到，结果见表1。
2.4.3指纹图谱的建立及相似度评价按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图2），并以CDF文件格式导出，指纹图谱采用药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2.版）对图谱进行初步分析，以S1为参考图谱，时间窗宽度设为0.1min，经全谱匹配共确立28个共有峰，并得到对照指纹图谱（R），按照平均数法建立对照特征图谱，并计算出相似度（K）。结果见表1和图2。
2.4.4信息熵方法对数据的分析设一个评价指标系统中有m个评价对象，n个评价指标，所形成的原始指标数据矩阵为X＝(Xij)mn。对于某项评价指标i，若得分越大，即概率（Pi）越大，信息熵（Hi）就会越小，权重系数（Wi）就会越大，表明i指标处于“无序”状态，在评价中所起的作用越大；反之，若Pi值相等，则表示i指标处于“有序”状态，在综合评价中不起作用。因此，可利用信息熵计算各指标的权重，为中药多指标提取的综合评价提供依据[14-15]。
9.00
33.86
35.51
32.00
31.12
17.89
36.47
18.40
33.69
19.20
49.39
51.88
56.62
55.04
27.26
62.33
34.93
54.32
2.55
5.09
4.70
8.93
10.23
4.45
11.08
6.49
5.62
X＝
0.59
1.46
1.57
1.55
1.86
0.94
1.44
1.50
1.42
2.93
4.44
2.86
5.77
6.87
3.08
5.25
6.73
4.74
16.25
28.93
27.50
27.86
29.82
19.11
28.57
21.43
28.39
0.
0.
0.
0.74
0.
0.
0.
0.
0.
本研究有9个评价对象，7个评价指标，将正交试验所得的结果数据建立成原始数据矩阵，包含9次试验所得的5个指标成分提取率、药材提取的干膏得率、指纹图谱相似度的结果。具体计算步骤如下[16]。
（1）建立原始评价指标矩阵(Xij)mn。
（2）计算Pij，将原始评价矩阵转为概率矩阵。
Pij＝Xij/Xij
Pij表示第j次实验在第i个评价指标下的概率，0≤Pi≤1
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.7
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
P＝
0.2
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
0.
（3）计算每项指标的Hi，结果Hi＝(0.，0.，0.，0.，0.，0.，0.9)。
（4）计算每项指标的Wi，结果Wi＝(0.，0.，0.，0.，0.，0.，0.)。
（5）根据各指标的权重，计算出综合评价指标，对正交试验数据进行综合分析。
从表2结果可知，橙皮苷提取量的Wi最大，则其Hi最小，说明在不同试验条件下，橙皮苷提取量变化最大，是需要重点考察的指标，其次是芍药苷。相似度的Wi最小，说明在不同的试验条件下，相似度的数值变化不明显。
对原始矩阵的数据进行加权处理得综合评价指标［M，M＝(Y1/Y1max×0.＋Y2/Y2max×0.＋Y3/Y3max×0.＋Y4/Y4max×0.＋Y5/Y5max×0.＋YG/YGmax×0.＋K/Kmax×0.)×］，综合评分结果见表1。
将综合评分作为数据，把A、B、C、D因素中均方最小值的因素D（提取次数）作为误差项[17-18]，利用SPSS20.0进行方差分析，计算结果见表3。由方差分析结果可知，各因素对综合指标的影响主次顺序为C＞A＞B，即提取时间＞乙醇体积分数＞提取溶剂倍量。其中因素C（提取时间）具有显著性差异（P＜0.05），其他因素无显著性差异（P＞0.05）。根据综合评分和方差分析结果，确定采用的最佳提取工艺条件为A2B1C3D2，即最佳提取工艺条件为6倍量的50%乙醇，提取时间为2h，提取2次。
2.5最佳工艺验证
按处方量称取药材，共3份，根据最佳提取工艺条件进行验证试验，平行操作3次，所得结果见表4。5种活性成分的提取率和出膏率RSD值在1.5%之内，综合评分稳定，说明该工艺可行性高，稳定性好，切实可行。
3讨论
XC是多味中药材组成的复方制剂，因需要工艺改造的7味药材有效成分大部分为醇溶性成分，选用乙醇作为提取溶剂，并通过正交设计结合指纹图谱对其提取工艺进行优化。现代药理研究表明，白芍中的芍药苷具有降血糖、免疫调节、抗肿瘤、扩张血管、改善微循环等药理作用[19]；当归中阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、调血脂、抗菌、抗病*、防癌等作用[20]；藁本内酯具有神经保护、舒张血管、抗肿瘤、镇痛、消炎作用[21]；陈皮和青皮中的橙皮苷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫力等作用[22]；白芷中的欧前胡素具有镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤作用[23]。这5种成分的药理作用与XC发挥疏肝理气、通络止痛、解*散结药效作用有关。延胡索乙素是元胡的主要活性成分，具有活血化瘀、理气止痛的功效，而制剂处方中元胡的用量较少，提取条件和色谱条件的设定使HPLC检测出的延胡索乙素含量较低，低于定量检测限，这与延胡索乙素测定相关的文献报道相符[24-25]，为了减少误差，本研究未将元胡中的延胡索乙素作为指标成分。
最终，本研究选择以上5种代表活性成分结合干膏得率、相似度作为检验指标。根据熵权法所得各指标的权重系数，其中橙皮苷的权重系数最大为0.，最小的是相似度0.，说明在该提取工艺评价系统中橙皮苷的变化最显著，影响最大，其次是芍药苷提取率，影响力最小的是相似度。综合评分结果经方差分析后得到的最佳提取工艺为：药材加入6倍量的50%乙醇，提取2次，每次2h，浓缩后减压干燥得到干浸膏。验证试验表明该提取工艺简单可行、稳定性较好，为该制剂进一步的药效研究提供了数据支持。
参考文献（略）
来源：陈丽津，汤浩，石磊，钱倩，蒲君峰.基于信息熵理论的正交设计优化消乳增胶囊的提取工艺[J].中草药,,50(14):-.
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